DUAL-KLAS-NIR Sistema de Medição de Fluorescência de Clorofila, P700, Plastocianina e Ferredoxina

A unidade de controle DUAL-KLAS-NIR (DKN-C) mantém as unidades de emissor e detector mantidas pelo Sistema de Posicionamento Linear na posição vertical no lado direito.

- Aplicando uma abordagem analítica inovadora, o DUAL-KLAS-NIR adquire as características espectrais in vivo do PC puro, P700 e Fd. Esta informação espectral permite que as alterações redox de P700, PC e Fd sejam monitoradas online, e as proporções de PC / P700 e Fd / P700 determinadas.
Como o DUAL-PAM-100, o DUAL-KLAS-NIR também é um fluorômetro de clorofila PAM. O dispositivo pode excitar a fluorescência por meio da luz de medição PAM verde ou azul. A luz verde penetra mais profundamente que a luz azul na folha. Portanto, a fluorescência excitada verde inclui informações das camadas mais profundas e, portanto, é adequada para comparação com as medições de absorção NIR que sempre sondam a folha inteira.

- O software DUAL-KLAS-NIR compartilha muitos recursos com o DUAL-PAM-100. Portanto, começar com o DUAL-KLAS-NIR é particularmente fácil para os usuários do DUAL-PAM-100. Usando rotinas automatizadas de medição do software DUAL-KLAS-NIR, até mesmo protocolos de medição complexos podem ser facilmente executados.

• Excelentes características técnicas:

- Os instrumentos NIR DUAL-KLAS podem medir em modo de 1, 2 ou 6 canais, com resoluções de tempo de 35 μs, 150 μs e 1 ms, respectivamente.
- A técnica de modulação de pulso desenvolvida para o DUAL-PAM-100, na qual os diferentes canais são medidos como blocos de 50 μs, foi estendida para que o DUAL-KLAS-NIR se adapte às medições de 6 canais ( veja a figura 2).
- O DUAL-KLAS-NIR usa uma luz de medição verde para medições de fluorescência para obter a melhor correspondência possível entre as medições de fluorescência e absorbância. Um segundo canal de fluorescência detecta a fluorescência induzida pela luz de medição azul. A luz de medição azul fornece informações mais específicas no lado superior ou inferior da folha e, além disso, fornece um sinal de fluorescência que é uma ordem de grandeza maior do que o sinal induzido pela luz de medição verde.

Esquema mostrando como as diferentes fontes de luz e o fotodiodo são orientados um ao outro no DUAL-KLAS-NIR. ML = luz de medição, AL = luz actínica, ST = flash de rotação simples, MT = pulso de rotação múltipla, FR = luz vermelha distante, COB = chip-on-board (LED-array).

Esquema que mostra como os pares de comprimentos de onda são medidos sequencialmente em blocos de 50 μs, após o que os sinais após mais alguns passos, com a ajuda dos diagramas de modelos diferenciais, são deconvolvidos e convertidos em sinais de PC , P700 e Fd.

• Modelos espectrais diferenciais (DMP) para a deconvolução de sinais NIR:

- Os espectros de absorção de P700, plastocianina (PC) e ferredoxina (Fd) são amplos e apresentam poucas características no infravermelho próximo (NIR). Uma complicação adicional é que o coeficiente de extinção do P700 é muito mais alto que o do PC, que novamente é maior que o coeficiente de extinção do Fd. Ao escolher pares de comprimentos de onda específicos, só é possível obter sinais NIR enriquecidos em Fd (785-820 nm), ou P700 (820-870 nm) ou PC (870-950 nm). Para chegar a uma deconvolução limpa, o software usa a abordagem de enredo de modelo diferencial (DMP), que não requer conhecimento dos espectros de diferença e da dependência do comprimento de onda dos coeficientes de extinção diferencial. Christof Klughammer desenvolveu este método pela primeira vez para o KLAS-100, um espectrofotômetro de matriz cinética de LED para a faixa de comprimento de onda de 510-570 nm.
- Conhecemos muito bem o comportamento do PC, P700 e Fd sob condições padrão e, com base nesse conhecimento, podemos projetar experimentos em que, por um curto período de tempo, apenas são feitas alterações redox de um dos três componentes ( PC, P700 ou Fd) ocorrem. Ao normalizar os valores determinados para os 4 sinais de diferença, é obtida uma "impressão digital espectral" para cada componente nas condições experimentais dadas. Também deve ser notado que os centros de ferro e enxofre de FA e FB localizados no lado do aceitador do fotossistema I também podem contribuir para o sinal Fd.

Mudanças na transmitância de um único comprimento de onda em uma folha intacta de girassol induzida sob condições que favorecem alterações redox seletivas de PC, P700 e Fd. O DUAL-KLAS-NIR foi usado no modo de feixe único (Schreiber 2017, Fig. 2). Para mais detalhes sobre este experimento, veja a legenda na Figura 4 em Klughammer e Schreiber (2016). A figura mostra que entre 780 e 820 nm o sinal Fd diminui em 30%, enquanto as mudanças no sinal de PC e P700 são pequenas ou essencialmente zero, respectivamente. Entre 820 e 870 nm, há uma grande diminuição no sinal P700, enquanto a alteração do sinal do PC é relativamente pequena. A mudança no sinal Fd também é grande (mudança de ~ 60%), mas a força do sinal Fd em termos absolutos é muito menor que a intensidade do sinal P700. Entre 870 e 965 nm, o PC e o P700 mostram uma redução comparável. O enriquecimento do PC nesta faixa de comprimento de onda é bem pequeno, mas é a melhor coisa que pode ser feita. A figura ilustra dois pontos: 1. por que os pares de comprimentos de onda específicos utilizados no DUAL-KLAS-NIR foram escolhidos e 2. que os valores precisos de comprimento de onda desses pares são menos importantes. Se, por exemplo, 950 nm for escolhido em vez de 965 nm, isso não afetará a abordagem de desconvolução.

Captura de tela do experimento usado para obter o DMP para o P700. Em uma folha adaptada à luz que é iluminada com luz vermelha distante, um pulso AL de 1 ms induz mudanças quase exclusivamente no sinal do P700.

Espectros de modelos diferenciais do P700, PC e Fd; o software usa esses DMPs para deconvolver os quatro sinais NIR.

Captura de tela da janela de luz de medição NIR após o balanceamento dos quatro pares de comprimentos de onda e importação dos espectros dos modelos diferenciais (DMP) da orquídea Phalaenopsis.

Captura de tela do Trig. Janela de execução, que mostra uma medição que consiste em três eventos: luz actínica (AL, vermelho) entre 3 e 6 s, luz vermelha distante (FR, rosa) entre 10 e 20 segundos e pulsos de rotação múltipla (MT, laranja) a 3,8 e 20 s. As execuções ativadas pertencem aos blocos de criação do arquivo de script.

Captura de tela da janela Adaptação, que mostra um experimento com uma folha Phalaenopsis para determinar o Fd-DMP (pulso de luz seguido por um período escuro) no painel esquerdo. Os quatro traços (mar verde, verde, amarelo e laranja) representam as medidas dos quatro pares de comprimentos de onda. As linhas púrpuras fornecem o intervalo usado para a análise e espera-se que somente a re-oxidação de Fd ocorra. Na janela inferior direita, há uma comparação entre o DMP dessa folha e a de uma hélice Hedera.

Captura de tela da janela de ajuste. Experimente uma folha de Phalaenopsis usada para determinar o P700-DMP (folha de adaptação de luz, luz FR, 1 ms com luz de fundo FR) mostrada no painel esquerdo. Os quatro traços (mar verde, verde, amarelo e laranja) representam as medidas dos quatro pares de comprimentos de onda. As linhas roxas indicam o intervalo utilizado para a análise e apenas as alterações redox P700 eram esperadas.

Captura de tela da janela Slow Kinetics mostrando o experimento com uma folha Phalaenopis para determinar o PC-DMP (adaptação da luz, luz FR, flash de saturação seguido de um período de escuridão). Os sinais foram deconvoluídos com base no DMP da Hedera helix incluído no software. O experimento mostra claramente que, além dos 9 s, apenas mudanças ocorrem no estado redox do PC sob essas condições. Um script que define a experiência é exibido como uma janela pop-up e foi alterado aqui na parte superior da janela Slow Kinetics.

Captura de tela da janela Relatório. A captura de tela mostra parte dos dados de um experimento Light Curve salvo em um arquivo de log.

Captura de tela da janela Slow Kinetics: uma indução (luz actínica: 119 μmol de fótons m-2 s-1) + experiência de recuperação (rosa: fluorescência de Chl, vermelho: PC; P700; verde: Fd), medida em Folha de Palaenopsis.

Captura de tela da Curva da janela de luz, com um exemplo de medição da Curva de Luz em uma folha de Phalaenopsis em etapas de 30 s. Apenas os parâmetros Y (I), ETR (I), Y (II) e ETR (II) são exibidos. A lista no lado direito do gráfico mostra todos os parâmetros que podem ser plotados. Os dados da ETR foram ajustados com o modelo de Eilers e Peeters (1988).

Captura de tela da janela SP-Analysis. Vários parâmetros PS I e PS II do experimento Light Curve são exibidos em função do tempo (cada ponto representa uma intensidade de luz). Além do ponto 6 (82 μmol fótons m-2 s-1) uma nova fase é estabelecida com PS I cada vez mais oxidado, PS II cada vez mais reduzida e uma nova fase na indução do NPQ.

Captura de tela da janela Performance Graph: o desempenho quântico efetivo do fotossistema I (Y (I)) é plotado em relação ao desempenho quântico efetivo do fotossistema II (Y (II)). Os dados foram retirados do experimento Light Curve mostrado em uma figura anterior. Entre ~ 100 e 830 (a maior intensidade medida) μmol fótons m-2 s-1, a relação entre os dois parâmetros é aproximadamente linear.

• Unidade de potência e controle DKN-C:

- Projeto geral: Microcontrolador: 4 x AVR-RISC (8 MHz) + 4 MB SRAM; Você pode armazenar 256.000 pontos de dados com uma resolução de 12 bits.
- Comunicação: interface PC: compatível com USB 1.1, 2.0 e 3.0
- Interface do usuário: computador Windows (Windows 7/8/10) com o software KLAS-100
- Fonte de alimentação: computador Windows (Windows 7/8/10) com o software KLAS-100
- Consumo de energia: durante a operação básica de 350 mA
- Jacks: 6 portas cabeças (comprimento de onda de energia para único (2 canais) e medição de luz modulada comprimento de onda duplo (4 canais), de alimentação para 2 matrizes actínica LED (um em DKN-E e em DKN D) e um conjunto de medição NIR LEDs (em DKN-e), dois sensores de entrada (detector de fotodiodo DKN-D é ligado ao detector 1), tomada agitador (mais controlador de velocidade e interruptor de espera ), AUX (por esférica Quantum Micro sensor US-SQS / ou US-MQS WB / BM), USB (cabo USB), gatilho para fora (5 V sinais rectangulares para activar dispositivos externos), 2 sinais EXT. ( entrada para sinais externos DC). Gama 0-1 V ou 0-5 V) e CHARGE (para o MINI-PAM / L carregador).
- Dimensões: 36 cm x 16 cm x 26,5 cm (largura x altura x largura), com alça de transporte
- Peso: 5,8 kg

• Unidade de emissão DKN-E:

- Medição da luz: a disposição de LED Chip-On-Board para medir luz NIR 780, 820, 840, 870 e 965 nm modulado de medição de fluorescência de luz verde pulsado (540 nm) de impulso modulada.
- luz actínica: matriz de LED Chip-On-Board (635 nm) para a luz actínica vermelho contínua (max. 2 m-1 s-PAR 2500 fotões micromol), ele pode também ser usado para flashes de uma única vez (máx. 250000 umol) fotões m-2s-1, comprimento de PAR 5-50 microssegundos), e vários impulsos de rotação (MT e SP) (max 25000 micromol fotões m-2 s-1 PAR, 1-1000 comprimento ms) ..
- Dimensões: 5,5 cm x 9 cm x 4 cm (largura x altura x largura)
- Peso: 560 g (incluindo cabos, 1,4 m de comprimento)

• Unidade de detecção DKN-D:

- Luz de medição: luz de medição de fluorescência de pulso azul (460 nm).
- luz actínica: (máx. 300 umol de m-2 s-1 PAR) luz azul (460 nm) para a luz azul contínua fichas chip array-On-Board (635 nm) para a iluminação vermelho contínua (max 2,500 umol m. - 2 s-1 PAR), que também podem ser utilizados para saturar pisca individuais de rotação (máx 250 000 umol de m-2 s-1 PAR, comprimento 5-50 microssegundos) e pulso rotação múltipla (MT e SP) (max. . 25000) fotões micromol m-2 s-1 PAR, 1-1000 comprimento ms), luz vermelha distante (740 nm) para a iluminação contínua longe-vermelho (máx. 400 micromol fotões m-2 s-1).
- detecção de sinal: fotodiodo e pré-amplificador de impulsos para medir quatro sinais de diferença de transmissão NIR duplo comprimento de onda (780-820, 820-870, 870-965 e 840-965 nm) e dois sinais de fluorescência. A resolução temporal de uma medição de um único canal é de 35 ms, uma medição de dois canais é de 150 microssegundos e uma 1ms de medição de 6 canais. O mesmo detector (protegido pelo mesmo conjunto de filtros) é usado para medições de fluorescência e transmissão NIR. O conjunto de filtros passa comprimentos de onda> 750 nm.
- Dimensões: 5,5 cm x 9 cm x 4 cm (largura x altura x largura)
- Peso: 540 g (incluindo cabos, 1,4 m de comprimento)

• Caixa de transporte DKN-T:

- Design: caixa de alumínio com embalagem de espuma personalizada para DUAL-KLAS-NIR e acessórios
- Dimensões: 60 cm x 40 cm x 34 cm (L x L x A)
- Peso: 5 kg

• Sistema de posicionamento linear 3010-DUAL / B:

- Desenho: composto por um fecho de correr de alumínio anodizado preto placa de base em que um suporte da cabeça de medição está montado sobre uma fase móvel que pode ser precisamente posicionada ao longo da cremalheira através de um ajuste lateral do botão. Inclui uma barra de suporte de laboratório de 13 cm que pode ser aparafusada na parte inferior da placa base e uma chave Allen de 3 mm
- Dimensões: 18,5 cm x 11,5 cm x 12 cm (C x L x A, máx sem barra de suporte de laboratório)
- Peso: 1050 g

• Especificações dos acessórios:

Cubeta de troca de gás DUAL-PAM-100 3010-DUAL:
- Desenho: balde que consiste de uma sanduíche de duas molduras de alumínio 2 x 2 cm, cada um segurando a extremidade de uma haste padrão Perspex Walz para ligar várias cabeças de medição DUAL-KLAS-NIR. Material de vedação entre armações e chapas: junta de espuma de silicone. Distância entre a haste de acrílico e a lâmina: ca. 1 mm de cada lado da folha. Metades do tanque superior e inferior separadas pneumaticamente, controladas por uma unidade de regulagem com soquetes para as conexões de cabos da unidade de controle 3000 C da GFS-3000. Área da folha examinada: 1,3 cm2. Medir a temperatura da folha: termopar, gama de -10 a 50 ° C, a precisão ± 0,2 ° C. quântica externa sensor de micro cosseno corrigido MQS/A para medições PAR variando 0-2500 mol de m-2 s -1, precisão ± 5%
- Temperatura de funcionamento: -5 a +45 ° C.
- Dimensões: cuvete montado: 10 cm x 4 cm x 12 cm (comprimento x largura x altura), caixa da electrónica 7 centímetros x 7 cm x 15 cm (comprimento x largura x altura)
- Peso: cuvete, unidade de regulação, cabos e estrutura de montagem: 1,7 kg; Suporte de montagem ST-101: 2 kg

Unidade óptica para suspensões ED-101US/MD:
- Design: Corpo em alumínio anodizado preto com recipiente de vidro central padrão de 10 x 10 mm; para a ligação da unidade transmissora DKN-E, a unidade de detecção DKN-D e o agitador magnético miniatura PHYTO-MS; Portas adicionais para a conexão de duas unidades adicionais de emissor ou detector.
- Peso: 750 g

Acessórios para ED-101US/MD:
- Bloco de controlo de temperatura ED-101US/T: bloco seccionado com uma abertura central de 10 x 10 mm para montagem na parte superior da unidade ED-101US/MD; para ser ligado a um banho de água de fluxo externo (não incluído), peso 250 g
- Agitador magnético miniatura PHYTO-MS: baseado em um dispositivo fabricado por h + p (tipo Variomag-Mini); com adaptador para montagem na porta inferior da unidade óptica ED-101US/MD; alimentado e controlado pela unidade de energia e controle DKN-C
- Sensor micro-quântico esférico US-SQS/WB: esfera difusora de ø 3,7 mm acoplada ao sensor PAR integrado através de fibra de 2 mm de diâmetro; unidade amplificadora compacta e suporte especial para montagem na unidade óptica ED-101US/MD; para conectar a unidade de controle e potência DKN-C

• Unidade de controle de temperatura US-T:

Unidade de energia e controle US-T/DR:
- Tela: tela LCD de três linhas
- Faixa de controle: 0 ° C a 50 ° C em passos de 0,1 K
- Tensão de operação: 11 V - 14 V DC
- Corrente máxima de Peltier: 1 A
- Tamanho: 105 mm x 90 mm x 130 mm (largura x altura x largura)
- Peso: 0,57 kg

Cabeça de transferência de calor Peltier US-T/DS:
- as temperaturas atingíveis: 12 K abaixo da temperatura ambiente, de 15 K acima da temperatura ambiente (cuvete de quartzo colocado na unidade óptica para suspensões ED-101US/MD com 1,5 ml de água e agitação PHYTO-MS sobre )
- Tamanho: ø 55 mm, altura 110 mm.
- Comprimento do cabo: 130 cm.
- Peso: 0,29 kg (cabo incluído)

Adaptador AC:
- Entrada: 100 V - 240 V AC, 1,5 A 50-60 Hz
- Saída: 12 V DC, 5,5 A
- Tamanho: 130 mm x 56 mm x 30 mm (L x L x A)
- Peso: 0,50 kg (cabo incluso)

Cuvete para medições de absorbância de baixa derivação DUAL-K25:
- Desenho: cuvete de quartzo de vidro, de seção transversal: 10 mm x 10 mm, dimensões externas: 12,5 milímetros x 12,5 mm x 26 mm (L x W x H). suporte de cuvete especial para colocar a tina entre as unidades de emissão e de detector e DKN DKN-D-E-KLAS DUAL-NIR. Escudos de alumínio anodizado preto em forma de U para proteger a luz externa. Três juntas de vedação para proteger a cabeça de medição de derrame inferior.

* Sujeito a alterações sem aviso prévio

- O DUAL-KLAS-NIR é único no fornecimento de sinais on-line dos estados redox in vivo do P700, PC e Fd em tempo real. Isso abre um novo campo de pesquisa com aplicativos que ainda não nos ocorreram. Em particular, pela primeira vez, informações cinéticas simultâneas podem ser obtidas sobre a interação complexa entre as reações nos lados doadores e o aceitador PS I, incluindo as informações sobre o transporte de elétrons cíclicos em torno do PS I.
- Alguns exemplos de aplicações, descritas em Klughammer e Schreiber, Photosynth Res 128 (2016) 195-214, Schreiber e Klughammer, Plant Cell Physiol 57 (2016) 1454-1467 e Schreiber Photosynth Res 134 (2017) 343-360 , eles são dados aqui

O desempenho quântico efetivo do fotossistema I. Em todas as medições anteriores, o sinal do P700 sempre continha contribuições de Fd e quantidades variáveis de PC, de acordo com o método utilizado para reduzir essa contribuição. O painel C da figura ilustra a dependência da intensidade de luz do rendimento quântico efetivo de PSI Y (I), o rendimento quântico efetivo de PSII Y (II) e o rendimento quântico efetivo de PSII corrigido pela fluorescência de PSI Y (II) Cor de Brassica napus.

O tamanho efetivo da antena do sistema fotográfico I. Em uma transição do escuro para a luz, o primeiro PC oxidado começa a se acumular e somente com um pequeno atraso do P700 oxidado. A inclinação inicial do sinal de PC limpo pode agora ser usada como uma medida para o tamanho efetivo da antena PS I. O segundo número foca nas mudanças iniciais de absorbância e mostra a grande diferença na inclinação inicial do PC ( vermelho) e P700 (azul). Para uma folha aclimatada à escuridão, com o lado aceptor do fotossistema inativo I, a inclinação inicial de redução de Fd também pode ser usada para essa finalidade. A figura ilustra o atraso na cinética de oxidação do P700 em relação às do PC para uma folha de cevada, que tem uma relação PC / P700 relativamente alta.

O DUAL-KLAS-NIR possui uma janela para visualizar as alterações simultâneas nos estados redox do P700 e do PC em relação aos demais. Isto permite uma estimativa da constante de equilíbrio aparente entre o PC e o P700. A figura mostra um exemplo de um gráfico redox P700 versus PC.

Durante um pulso de saturação dado a uma folha bem adaptada à escuridão, a poça de Fd é reduzida e, num período posterior de escuridão, é lentamente oxidada novamente. Quando o fluxo de elétrons no lado do receptor do PSI foi ativado, a cinética da reoxidação se torna muito mais rápida. Após a ativação do lado do receptor PSI, a inativação escura pode ser monitorada monitorando a taxa na qual Fd se torna oxidado após um pulso de sonda. Essas cinéticas podem ser ajustadas com uma rotina de ajuste exponencial. O painel A fornece exemplos da cinética de reoxidação de Fd ajustada com uma rotina de ajuste exponencial e o Painel B mostra a cinética de inativação escura do lado do receptor PSI para uma lâmina helicoidal Hedera.

As mudanças de transmissão NIR máximas de PC, P700 e Fd são proporcionais ao conteúdo folha / amostra destes compostos e as razões dos coeficientes de extinção de PC, P700 e Fd são constantes. Isto torna possível testar as proporções PC / P700 e Fd / P700 e, portanto, os tamanhos relativos de PC e Fd em diferentes espécies ou em condições diferentes (por exemplo, sol / sombra, estressado / não estressado) rotineiramente com o DUAL-KLAS-NIR. Observa-se que as altas razões PC / P700 se correlacionam com altos valores de ETR. A figura ilustra que as folhas de sol e sombra, neste caso, Hedera helix têm conteúdos PC e Fd consideravelmente diferentes em relação ao P700.