DUAL-KLAS-NIR Sistema de Medida de Fluorescencia de Clorofila, P700, Plastocianina y Ferredoxina

La unidad de control DUAL-KLAS-NIR (DKN-C) se queda con las unidades de emisor y detector mantenidas por el Sistema de posicionamiento lineal en la posición vertical en el lado derecho.

- Al aplicar un enfoque analítico innovador, el DUAL-KLAS-NIR adquiere las características espectrales in vivo de PC puro, P700 y Fd. Esta información espectral permite monitorear en línea los cambios redox de P700, PC y Fd, y determinar las proporciones de PC / P700 y Fd / P700.
Al igual que el DUAL-PAM-100, el DUAL-KLAS-NIR también es un fluorómetro de clorofila PAM. El dispositivo puede excitar la fluorescencia mediante luz de medición PAM verde o azul. La luz verde penetra más profundamente que la luz azul en la hoja. Por lo tanto, la fluorescencia excitada en verde incluye información de capas de hojas más profundas y, por lo tanto, es adecuada para la comparación con las mediciones de absorción NIR que siempre sondean toda la hoja.

- El software del DUAL-KLAS-NIR comparte muchas características con el del DUAL-PAM-100. Por lo tanto, comenzar con DUAL-KLAS-NIR es particularmente sencillo para los usuarios de DUAL-PAM-100. Usando rutinas de medición automatizadas del software DUAL-KLAS-NIR, incluso los protocolos de medición complejos se pueden realizar fácilmente.

• Características técnicas sobresalientes

- Los instrumentos DUAL-KLAS NIR pueden medir en modo de 1, 2 o 6 canales, con resoluciones de tiempo de 35 µs, 150 µs y 1 ms, respectivamente.
- La técnica de modulación de pulso desarrollada para el DUAL-PAM-100, en la cual los diferentes canales se miden como bloques de 50 µs, se ha extendido para que el DUAL-KLAS-NIR se adapte a las mediciones de 6 canales (ver Fig. 2).
- El DUAL-KLAS-NIR usa una luz de medición verde para las mediciones de fluorescencia para obtener la mejor coincidencia posible entre las mediciones de fluorescencia y absorbancia. Un segundo canal de fluorescencia detecta la fluorescencia inducida por la luz de medición azul. La luz de medición azul proporciona información más específica en el lado superior o inferior de la hoja y, además, proporciona una señal de fluorescencia que es un orden de magnitud mayor que la señal inducida por la luz de medición verde.

• Otras características distintivas de la DUAL-KLAS-NIR:

- LEDs actínicos rojos, azules y rojo lejanos integrados, por lo que la matriz de LED rojos de 635 nm se utiliza como fuente de luz para la luz actínica continua, pulsos de recambio múltiple y flashes de recambio únicos. El LED azul de 460 nm en la unidad del detector permite una iluminación continua con 300 µmol m-2 s-1 desde el lado del detector de la muestra.
- La medición de cuatro pares de longitudes de onda en el infrarrojo cercano: 785-820, 820-870, 870-950, 840-950 nm.
- Ambos lados de la hoja se pueden iluminar para lograr la iluminación más homogénea posible de la hoja.
- Un rango extremadamente amplio de medición de frecuencias de luz (1 Hz a 400 kHz permite la evaluación continua del nivel de FO, así como el registro de transitorios cinéticos rápidos a alta resolución temporal (por ejemplo, la cinética de aumento de fluorescencia polifásica o de relajación del flash).
- Todas las fuentes de luz se pueden cambiar con una resolución de tiempo de 2.5 µs bajo el control del software. Si se realizan mediciones de un solo canal, se dispone de un script con el cual las diferentes señales se pueden medir consecutivamente con una resolución de tiempo alta.
- Otras características técnicas importantes son: 1. Grabaciones automatizadas de cinética lenta; 2 carreras activadas preprogramadas; 3. promedios en línea y fuera de línea; 4. Operación del instrumento mediante rutinas de medición automatizadas (programación de archivo de script).

Esquema que muestra cómo las diferentes fuentes de luz y el fotodiodo se orientan entre sí en el DUAL-KLAS-NIR. ML = luz de medición, AL = luz actínica, ST = flash de rotación única, MT = pulso de rotación múltiple, FR = luz roja lejana, COB = chip-on-board (LED-array).

Esquema que muestra cómo los pares de longitudes de onda se miden secuencialmente en bloques de 50 µs, después de lo cual las señales después de algunos pasos más, con la ayuda de los diagramas de modelos diferenciales, se deconvolucionan y se convierten en señales de PC, P700 y Fd.

• Modelos espectrales diferenciales (DMP) para la desconvolución de las señales NIR:

- Los espectros de absorción de P700, plastocianina (PC) y ferredoxina (Fd) son amplios y muestran pocas características en el infrarrojo cercano (NIR). Una complicación adicional es que el coeficiente de extinción de P700 es mucho más alto que el de PC, que nuevamente es más alto que el coeficiente de extinción de Fd. Al elegir pares de longitudes de onda específicos, solo es posible obtener señales NIR enriquecidas en Fd (785-820 nm), o P700 (820-870 nm) o PC (870-950 nm). Para llegar de allí a una deconvolución limpia, el software utiliza el enfoque de la trama del modelo diferencial (DMP), que no requiere el conocimiento de los espectros de diferencia y la dependencia de la longitud de onda de los coeficientes de extinción diferencial. Christof Klughammer desarrolló por primera vez este método para el KLAS-100, un espectrofotómetro de matriz de LED cinético para el rango de longitud de onda de 510-570 nm.
- Conocemos bastante bien el comportamiento de PC, P700 y Fd en condiciones estándar y, sobre la base de ese conocimiento, podemos diseñar experimentos en los que, durante un breve período de tiempo, solo se realizan cambios redox de uno de los tres componentes (PC , P700 o Fd) ocurren. Por normalización de los valores determinados para las 4 señales de diferencia, se obtiene una "huella digital espectral" para cada componente en las condiciones experimentales dadas. También debe señalarse que los centros de hierro y azufre de FA y FB ubicados en el lado del aceptor del fotosistema I también pueden contribuir a la señal Fd.

Cambios de transmitancia de longitud de onda única en una hoja de girasol intacta inducida bajo condiciones que favorecen cambios redox selectivos de PC, P700 y Fd. El DUAL-KLAS-NIR se utilizó en el modo de haz único (Schreiber 2017, Fig. 2). Para más detalles sobre este experimento, vea la leyenda de la Figura 4 complementaria en Klughammer y Schreiber (2016). La figura muestra que entre 780 y 820 nm la señal Fd disminuye en un 30%, mientras que los cambios en la señal de PC y P700 son pequeños o esencialmente cero, respectivamente. Entre 820 y 870 nm, hay una gran disminución en la señal del P700, mientras que el cambio de la señal de la PC es relativamente pequeño. El cambio en la señal Fd también es grande (cambio de ~ 60%), pero la intensidad de la señal Fd en términos absolutos es mucho menor que la intensidad de la señal P700. Entre 870 y 965 nm, PC y P700 muestran una disminución comparable. El enriquecimiento de la PC en este intervalo de longitud de onda es bastante pequeño, pero es lo mejor que se puede hacer. La figura ilustra dos puntos: 1. por qué se eligieron los pares de longitud de onda particulares utilizados en el DUAL-KLAS-NIR y 2. que los valores de longitud de onda precisos de estos pares son menos importantes. Si por ejemplo Se elige 950 nm en lugar de 965 nm, que no afectará el enfoque de deconvolución.

Captura de pantalla del experimento utilizado para obtener el DMP para P700. En una hoja adaptada a la luz que se ilumina con luz roja lejana, un pulso AL de 1 ms induce cambios casi exclusivamente en la señal del P700.

Espectros de modelos diferenciales del P700, PC y Fd; el software utiliza estos DMP para deconvolute de las cuatro señales NIR.

• Software KLAS-100

Características generales e interfaz gráfica de usuario:

- El software KLAS-100 utilizado para las mediciones DUAL-KLAS-NIR está escrito en la tradición del software DUAL-PAM-100. Le permite al usuario preparar la muestra rápidamente para la deconvolución de la señal en línea y las mediciones que el usuario tiene en mente a través de una secuencia fija de pasos. Se proporciona un script para determinar las amplitudes máximas de la señal P700, PC y Fd (comparables a la determinación Pm del DUAL-PAM-100). Se miden cuatro pares de longitud de onda NIR y las contribuciones de P700, PC y Fd a estas señales NIR se determinan utilizando los llamados gráficos de modelo diferencial o DMP. Las parcelas de modelos diferenciales para Hedera helix están incluidas en el software y también pueden usarse con bastante éxito para otras especies de plantas. A través de una secuencia fija de pasos, haciendo uso de los scripts incluidos en el software para la determinación de cada DMP (P700, PC y Fd), el usuario puede crear su propio conjunto de DMP para el organismo fotosintético que se estudia.
- El software tiene una ventana para el análisis del pulso de saturación y una para las curvas de luz, como en el software DUAL-PAM-100, pero luego incluye un análisis de los estados redox de PC y Fd. Al igual que para el DUAL-PAM-100, el software calcula automáticamente los parámetros de relación de fluorescencia clásicos, así como los parámetros sugeridos más recientemente. En una nueva ventana es posible trazar los estados redox de P700 y PC entre sí, lo que da una idea acerca del equilibrio redox entre los dos. Se pueden crear archivos de activación y los archivos de secuencia de comandos que, combinados, permiten la ejecución reproducible de complejos protocolos experimentales. Si bien se requieren conocimientos previos para la programación de archivos y scripts de activación, incluso los no expertos pueden ejecutar de manera confiable protocolos muy sofisticados. El software le brinda al usuario la flexibilidad para crear casi cualquier protocolo experimental que pueda imaginarse para el análisis de procesos relacionados con el transporte de electrones.

Captura de pantalla de la ventana de luz de medición NIR luego del balanceo de los cuatro pares de longitudes de onda e importación de los espectros de modelo diferencial (DMP) de la orquídea Phalaenopsis.

Captura de pantalla del Trig. Ventana de ejecución, que muestra una medición que consta de tres eventos: luz actínica (AL, rojo) entre 3 y 6 s, luz roja lejana (FR, rosa) entre 10 y 20 s y pulsos de rotación múltiples (MT, naranja) a 3.8 y 20 s. Las ejecuciones activadas pertenecen a los bloques de creación de archivos de script.

Captura de pantalla de la ventana Adaptación, que muestra un experimento con una hoja de Phalaenopsis para determinar el Fd-DMP (pulso de luz seguido de un período oscuro) en el panel izquierdo. Las cuatro trazas (verde mar, verde, amarillo y naranja) representan las medidas de los cuatro pares de longitudes de onda. Las líneas moradas proporcionan el intervalo utilizado para el análisis y solo se espera que se produzca la re-oxidación de Fd. En la ventana inferior derecha se muestra una comparación entre el DMP de esta hoja y el de una hélice Hedera.

Captura de pantalla de la ventana de ajuste. Experimente con una hoja de Phalaenopsis utilizada para determinar el P700-DMP (hoja de adaptación a la luz, luz FR, 1 ms MT con luz de fondo FR) que se muestra en el panel izquierdo. Las cuatro trazas (verde mar, verde, amarillo y naranja) representan las medidas de los cuatro pares de longitudes de onda. Las líneas púrpuras indican el intervalo utilizado para el análisis y solo se esperaban cambios redox P700.

Captura de pantalla de la ventana de Slow Kinetics que muestra el experimento con una hoja de Phalaenopis para determinar el PC-DMP (adaptación de luz, luz de FR, flash de saturación seguido de un período de oscuridad). Las señales se deconvoluyeron en base a los DMP de Hedera helix incluidos en el software. El experimento muestra claramente que más allá de los 9 s solo se producen cambios en el estado redox de la PC en estas condiciones. Una secuencia de comandos que define el experimento se muestra como una ventana emergente y se cambió aquí en la parte superior de la ventana de Slow Kinetics.

Captura de pantalla de la ventana Informe. La captura de pantalla muestra parte de los datos de un experimento de Light Curve guardados en un archivo de registro.

Captura de pantalla de la ventana de Slow Kinetics: una inducción (luz actínica: 119 µmol fotones m-2 s-1) + experimento de recuperación (rosa: Chl fluorescencia; rojo: PC; P700; verde: Fd), medido en una hoja de Palaenopsis .

Captura de pantalla de la ventana Curva de luz, con un ejemplo de medición de Curva de luz en una hoja de Phalaenopsis en pasos de 30 s. Solo se muestran los parámetros Y (I), ETR (I), Y (II) y ETR (II). La lista en el lado derecho del gráfico muestra todos los parámetros que se pueden trazar. Los datos de ETR se ajustaron con el modelo de Eilers y Peeters (1988).

Captura de pantalla de la ventana de SP-Analysis. Varios parámetros PS I y PS II del experimento de Curva de luz se muestran en función del tiempo (cada punto representa una intensidad de luz). Más allá del punto 6 (82 µmol fotones m-2 s-1) se establece una nueva fase con PS I cada vez más oxidada, PS II cada vez más reducida y una nueva fase en la inducción NPQ.

Captura de pantalla de la ventana Gráfico de rendimiento: el rendimiento cuántico efectivo del fotosistema I (Y (I)) se representa en función del rendimiento cuántico efectivo del fotosistema II (Y (II)). Los datos se tomaron del experimento Curva de luz que se muestra en una figura anterior. Entre ~ 100 y 830 (la intensidad más alta medida) µmol fotones m-2 s-1, la relación entre los dos parámetros es aproximadamente lineal.

• Unidad de potencia y control DKN-C:

- Diseño general: Microcontrolador: 4 x AVR-RISC (8 MHz) + 4 MB SRAM; Se pueden almacenar 256 000 puntos de datos con una resolución de 12 bits.
- Comunicación: interfaz de PC: USB 1.1, 2.0 y 3.0 compatible
- Interfaz de usuario: computadora con Windows (Windows 7/8/10) con el software KLAS-100
- Fuente de alimentación: computadora con Windows (Windows 7/8/10) con el software KLAS-100
- Consumo de energía: durante el funcionamiento básico 350 mA
- Enchufes: 6 puertos para cabezales (potencia para longitud de onda simple (2 canales) y luz de medición modulada de longitud de onda doble (4 canales), potencia para 2 matrices de LED actínicas (una en DKN-E y una en DKN-D) y 1 medición NIR conjunto de luces LED (en DKN-E), entrada para 2 detectores (el detector de fotodiodos de DKN-D está conectado al detector 1), toma para agitador (más controlador de velocidad e interruptor de espera), AUX (para Spherical Micro Quantum Sensor US-SQS/WB o US-MQS/WB), USB (para cable USB), TRIGGER OUT (salida de señales rectangulares de 5 V para activar dispositivos externos), 2 SEÑALES EXT. (Entrada para señales externas de DC). Rango 0-1 V o 0-5 V), y CHARGE (para el cargador MINI-PAM/L).
- Dimensiones: 36 cm x 16 cm x 26.5 cm (ancho x alto x ancho), con asa de transporte
- Peso: 5,8 kg.

• Unidad de emisión DKN-E:

- Luz de medición: conjunto de LED Chip-On-Board para luz de medición NIR de 780, 820, 840, 870 y 965 nm modulada por impulsos, luz verde de medición de fluorescencia (540 nm) modulada por impulsos.
- Luz actínica: conjunto de LED Chip-On-Board (635 nm) para iluminación actínica roja continua (máx. 2500 µmol fotones m-2 s-1 PAR), que también se puede utilizar para flashes de un solo giro (máx. 250000 µmol) fotones m-2 s-1 PAR, longitud 5-50 µs), y pulsos de rotación múltiples (MT y SP) (máx. 25000 µmol fotones m-2 s-1 PAR, longitud 1-1000 ms).
- Dimensiones: 5,5 cm x 9 cm x 4 cm (ancho x alto x ancho)
- Peso: 560 g (incl. Cables, 1.4 m de largo)

• Unidad de detección DKN-D:

- Luz de medición: luz de medición de fluorescencia azul modulada por impulsos (460 nm).
- Luz actínica: luz azul (460 nm) para iluminación azul continua (máx. 300 µmol m-2 s-1 PAR), matriz de chips Chip-On-Board (635 nm) para iluminación roja continua (máx. 2500 µmol m- 2 s-1 PAR), que también se puede utilizar para saturar flashes de rotación individuales (máx. 250000 µmol m-2 s-1 PAR, longitud 5-50 µs) y pulsos de rotación múltiples (MT y SP) (máx. 25000) µmol fotones m-2 s-1 PAR, longitud 1-1000 ms), luz roja lejana (740 nm) para iluminación continua roja lejana (máx. 400 µmol fotones m-2 s-1).
- Detección de señal: fotodiodo y preamplificador de pulso para medir cuatro señales de diferencia de transmisión NIR de longitud de onda dual (780-820, 820-870, 870-965 y 840-965 nm) y dos señales de fluorescencia. La resolución temporal de una medición de un solo canal es de 35 µs, de una medición de dos canales es de 150 µs y de una medición de 6 canales de 1 ms. El mismo detector (protegido por el mismo conjunto de filtros) se utiliza para las mediciones de transmisión de fluorescencia y NIR. El conjunto de filtros pasa longitudes de onda> 750 nm.
- Dimensiones: 5,5 cm x 9 cm x 4 cm (ancho x alto x ancho)
- Peso: 540 g (incluyendo cables, 1.4 m de largo)

• Caja de transporte DKN-T:

- Diseño: caja de aluminio con embalaje de espuma personalizado para DUAL-KLAS-NIR y accesorios
- Dimensiones: 60 cm x 40 cm x 34 cm (L x W x H)
- Peso: 5 kg.

• Sistema de posicionamiento lineal 3010-DUAL/B:

- Diseño: compuesto por una placa de base de aluminio anodizado negro con cremallera en la cual se monta un soporte de cabezal de medición en un escenario móvil que se puede posicionar con precisión a lo largo de la cremallera mediante un botón de ajuste lateral. Incluye una barra de soporte de laboratorio de 13 cm que se puede atornillar a la parte inferior de la placa base y una llave Allen de 3 mm
- Dimensiones: 18,5 cm x 11,5 cm x 12 cm (L x W x H, máx. Sin barra de soporte de laboratorio)
- Peso: 1050 g

• Especificaciones de los accesorios:

DUAL-PAM-100 Cubeta de intercambio de gases 3010-DUAL:
- Diseño: cubeta que consiste en un sándwich de dos marcos de aluminio de 2 x 2 cm, cada uno sosteniendo la parte final de una varilla de Perspex estándar de Walz para conectar varios cabezales de medición del DUAL-KLAS-NIR. Material de sellado entre marcos y hojas: junta de espuma de silicona. Distancia entre la varilla de plexiglás y la hoja: ca. 1 mm en cada lado de la hoja. Mitades de cubeta superior e inferior separadas neumáticamente, controladas por una unidad reguladora con tomas para las conexiones de cable a la unidad de control 3000 C del GFS-3000. Área de la hoja examinada: 1,3 cm2. Medición de la temperatura de la hoja: termopar, rango -10 a +50 ° C, precisión ± 0.2 ° C. Sensor micro cuántico externo corregido en el coseno MQS/A para mediciones PAR que varían de 0 a 2500 µmol m-2 s-1, precisión ± 5%
- Temperatura de funcionamiento: -5 a +45 ° C.
- Dimensiones: cubeta ensamblada: 10 cm x 4 cm x 12 cm (largo x ancho x alto), caja electrónica: 7 cm x 7 cm x 15 cm (largo x ancho x alto)
- Peso: cubeta, unidad de regulación, cables y bastidor de montaje: 1,7 kg; soporte de montaje ST-101: 2 kg

Unidad óptica para suspensiones ED-101US/MD:
- Diseño: Cuerpo de aluminio anodizado negro con cubeta de vidrio estándar central de 10 x 10 mm; para la conexión de la unidad emisora ​​DKN-E, la unidad detectora DKN-D y el agitador magnético en miniatura PHYTO-MS; puertos adicionales para la conexión de dos unidades adicionales de emisor o detector.
- Peso: 750 g

Accesorios para ED-101US/MD:
- Bloque de control de temperatura ED-101US/T: bloque seccionado con una abertura central de 10 x 10 mm para ser montado en la parte superior de la unidad ED-101US/MD; para ser conectado a un baño de agua de flujo externo (no incluido), peso 250 g
- Agitador magnético miniatura PHYTO-MS: basado en un dispositivo fabricado por h + p (tipo Variomag-Mini); con adaptador para montar en el puerto inferior de la unidad óptica ED-101US/MD; alimentado y controlado por la unidad de potencia y control DKN-C
- Sensor esférico micro cuántico US-SQS/WB: esfera difusora de ø de 3,7 mm acoplada al sensor PAR integrado a través de fibra de 2 mm de diámetro; unidad de amplificador compacto y soporte especial para el montaje en la unidad óptica ED-101US/MD; para conectarse a la unidad de control y potencia DKN-C

• Unidad de control de temperatura US-T:

Unidad de potencia y control US-T/DR:
- Pantalla: Pantalla LCD de tres líneas
- Rango de control: 0 ° C a 50 ° C en pasos de 0,1 K
- Tensión de funcionamiento: 11 V - 14 V DC
- Corriente máxima de Peltier: 1 A
- Tamaño: 105 mm x 90 mm x 130 mm (ancho x alto x ancho)
- Peso: 0,57 kg.

Cabezal de transferencia de calor Peltier US-T/DS:
- Temperaturas alcanzables: 12 K por debajo de la temperatura ambiente, 15 K por encima de la temperatura ambiente (cubeta de cuarzo colocada en la unidad óptica para suspensiones ED-101US/MD con 1,5 ml de agua y agitador  PHYTO-MS encendido)
- Tamaño: ø 55 mm, altura 110 mm.
- Longitud del cable: 130 cm.
- Peso: 0,29 kg (cable incluido)

Adaptador de AC:
- Entrada: 100 V - 240 V AC, 1.5 A 50-60 Hz
- Salida: 12 V DC, 5.5 A
- Tamaño: 130 mm x 56 mm x 30 mm (L x W x H)
- Peso: 0,50 kg (cable incluido)

Cubeta para mediciones de absorbancia de baja deriva DUAL-K25:
- Diseño: cubeta de vidrio de cuarzo, sección transversal: 10 mm x 10 mm, dimensiones externas: 12,5 mm x 12,5 mm x 26 mm (L x W x H). Soporte especial de cubetas para colocar la cubeta entre las Unidades de Detector y Emisor DKN-D y DKN-E del DUAL-KLAS-NIR. Escudos de aluminio anodizado negro en forma de U para proteger la luz externa. Tres juntas de sellado para proteger el cabezal de medición inferior de derrames.

* Sujeto a cambios sin previo aviso

- El DUAL-KLAS-NIR es único en el suministro de señales en línea de los estados redox in vivo de P700, PC y Fd en tiempo real. Esto abre un nuevo campo de investigación con aplicaciones que aún no se nos han ocurrido. En particular, por primera vez se puede obtener información cinética simultánea sobre la compleja interacción entre las reacciones en los lados del donante y el aceptor de PS I, incluida la información sobre el transporte de electrones cíclicos alrededor de PS I.
- Algunos ejemplos de aplicaciones, que se han descrito en Klughammer y Schreiber, Photosynth Res 128 (2016) 195-214, Schreiber y Klughammer, Plant Cell Physiol 57 (2016) 1454-1467 y Schreiber Photosynth Res 134 (2017) 343-360 , se dan aqui

El rendimiento cuántico efectivo del fotosistema I. En todas las mediciones anteriores, la señal del P700 contenía siempre contribuciones de Fd y cantidades variables de PC, según el método utilizado para reducir esta contribución. El panel C de la figura ilustra la dependencia de la intensidad de la luz del rendimiento cuántico efectivo de PSI Y (I), el rendimiento cuántico efectivo de PSII Y (II) y el rendimiento cuántico efectivo de PSII corregido por la fluorescencia de PSI Y (II) corr de Brassica napus .

El tamaño efectivo de la antena del fotosistema I. En una transición de oscuridad a luz, la primera PC oxidada comienza a acumularse y solo con un poco de retardo del P700 oxidado. La pendiente inicial de la señal de PC limpia ahora se puede usar como una medida para el tamaño efectivo de la antena de PS I. La segunda figura se enfoca en los cambios de absorbancia iniciales y muestra la gran diferencia en la pendiente inicial de PC (rojo) y P700 (azul). Para una hoja aclimatada a la oscuridad, con el lado aceptor del fotosistema inactivo I, la pendiente inicial de reducción de Fd también se puede usar para este propósito. La figura ilustra el retraso en la cinética de oxidación de P700 con respecto a las de PC para una hoja de cebada, que tiene una relación PC / P700 relativamente alta.

El DUAL-KLAS-NIR tiene una ventana para visualizar los cambios simultáneos en los estados redox de P700 y PC en relación a los demás. Esto permite una estimación de la constante de equilibrio aparente entre PC y P700. La figura muestra un ejemplo de una gráfica redox P700 versus PC.

Durante un pulso de saturación dado a una hoja bien adaptada a la oscuridad, el Fd-pool se reduce y en un período posterior de oscuridad se vuelve a oxidar lentamente. Cuando el flujo de electrones en el lado aceptor de PSI se ha activado, la cinética de reoxidación se vuelve mucho más rápida. Después de la activación del lado aceptor de PSI, la inactivación oscura puede seguirse monitoreando la velocidad a la que Fd se vuelve a oxidar después de un pulso de sonda. Estas cinéticas se pueden ajustar con una rutina de ajuste exponencial. El panel A proporciona ejemplos de la cinética de reoxidación Fd ajustada con una rutina de ajuste exponencial y el panel B muestra la cinética de inactivación oscura del lado aceptor de PSI para una hoja de hélice Hedera.

Los cambios máximos de transmitancia NIR de PC, P700 y Fd son proporcionales al contenido de hoja / muestra de estos compuestos y las relaciones de los coeficientes de extinción de PC, P700 y Fd son constantes. Esto permite probar las proporciones PC / P700 y Fd / P700 y, por lo tanto, los tamaños relativos de PC y Fd en diferentes especies o en diferentes condiciones (por ejemplo, sol / sombra, estresado / no estresado) de forma rutinaria con el DUAL -KLAS-NIR. Se observa que las altas relaciones PC / P700 se correlacionan con valores altos de ETR. La figura ilustra que las hojas de sol y sombra de, en este caso, Hedera helix tienen contenidos de PC y Fd considerablemente diferentes en relación con el P700.